从苦参(Sophoraflavescens)中分离到苦参碱型生物碱及其抗乙型肝炎病毒活性

张若宇

内容介绍

从苦参(Sophoraflavescens)根中分离得到8种苦参碱类生物碱，分别为：flavesinesG-J(-4)、alopecurineB(5)、7,-脱氢-氧化苦参碱(6)、0-氧-5,6-脱氢苦参碱(7)和0-氧化槐定碱(8)，以及9种已知的类似物(9-7)。化合物-3是第一个具有D环开环的天然苦参碱类生物碱，而化合物4代表了一个前所未有的由苦参碱和哌啶构建的二聚结构，5是具有C-5-C-6键断裂的苦参碱类生物碱的第一个例子。利用核磁共振波谱、质谱、红外光谱和紫外光谱等分析手段对新结构进行了阐明，并用单晶X射线衍射和ECD数据确定了新结构的绝对构型。对分离的生物碱进行抗乙型肝炎病毒活性评价，化合物、4、5、0和4表现出与苦参碱相当的抗病毒活性。

结构解析

化合物

化合物以无色块状晶体形式从MeOH-H2O(2:)，mp95-96°C中分离得到，其分子式为C5H20N2O2(m/z26.[m+H]+，计算值为C5H2N2O2，26.)。和cm-处的红外吸收光谱表明存在羟基和羰基。HNMR谱图显示在δH7.63(H，s)处存在烯烃质子。3CNMR谱图显示有5个碳，包括一个羧酸(δC8.4)和一个四取代吡啶环(δC53.8、50.、35.7、6.9和5.4)以及两个连接到杂原子的亚甲基(δC5.4和50.7)。除上述信号外，该生物碱还含有7个亚甲基碳原子(δC38.、3.4、26.5、25.2、23.3、2.0和20.9)。借助H–HCOSY、HSQC和HMBC的二维核磁共振实验，将的H和3C核磁共振数据进行了归属。

H2-2(δH3.45)/H2-3(δH.98)/H2-4(δH2.7)、H2-8(δH2.75)/H2-9(δH.98)/H2-0(δH3.45)和H2-2(δH2.72)/H2-3(δH.87)/H2-4(δH2.23)的H-HCOSY相关表明存在三个自旋系统(C-2到C-4、C-8到C-0和C-2到C-4)。结合H2-8与C-6(δC53.7)、C-0(δC50.7)、C-(δC50.)、H2-3与C-、C-5(δC8.4)、H2-4与C-2(δC3.4)、C-5以及H2-7(δH7.63)与C-4(δC25.2)、C-5(δC6.9)、C-6、C-之间的HMBC相关，确定的平面结构。最后，通过单晶X射线衍射(CuKα)分析证实了的结构，并将其命名为flavesineG。

化合物2

化合物2(flavesineH)根据其HRESIMS数据给出了C5H22N2O2的分子式。其红外光谱显示了羰基(cm-)和羟基(cm-)的吸收。2的3C核磁共振谱显示了一个羧酸基(δC8.9)、三个烯烃碳(δC49.8、5.4和4.3)、两个甲基(δC57.和39.5)和两个连接到杂原子的亚甲基(δC53.和52.4)的信号，表明其结构与类似。最显著的差异是在中C-7(δC5.4)和C-(δC50.)的烯烃氢化成2个甲基(δC57.和39.5)。2的相对构型是通过H-和H-8a之间以及H-7和H-2a之间的NOESY相关性推导出来的。此外，利用含时密度泛函理论(TDDFT)方法，通过比较实验和计算的电子圆二色性(ECD)光谱，确定了2的绝对构型。所得结果表明，2的实验ECD谱和(7S，S)-2的计算ECD谱是一致的，允许将绝对构型确定为7S和S。

化合物3

化合物3(flavesineI)在m/z.处出现[M+H]+离子峰，与分子式C5H22N2O2一致。3的H和3C核磁共振谱也与相似，除了存在额外的甲基(δC35.7)、连接到杂原子的额外亚甲基(δC45.5)和缺失两个烯烃碳(δC35.7和6.9)以及C-4、C-6、C-7和C-的化学位移从δC25.2、53.7、5.4、50.至δC23.、63.7、96.4、69.9。这些差异表明C-5和C-7之间的双键是氢化的。其次，用H2-2(δH3.45)/H2-3(δH.94)/H2-4(δH2.0，.34)/H-5(δH2.79)/H2-7(δH3.5，3.09)的H-HCOSY相关，以及H-7b与C-4(δC23.)、C-6(δC63.7)、C-(δC69.9)和H-2a与C-7(δC96.4)、C-之间的HMBC相关来确定3的结构。虽然3的C-5处有手性中心，但3的光学活性和cotton效应都很弱，不易检测，说明3是一个外消旋体。用手性分析条件不能分离化合物3。因此，3为外消旋混合物。

化合物4

化合物4(flavesineJ)是黄色油状。用HRESIMS(m/z.[m+H]+，计算值为C20H30N3O，.)确定了4的分子式为C20H29N3O。4的H和3C核磁共振数据与的对比显示出许多相似之处，除了有一个额外的哌啶环(δC48.0、43.9、27.6、26.8和25.5)外，C-4和C-5的化学位移从δC38.和8.4到δC33.7和73.4。这些差异表明，哌啶环通过4的酰胺键与苦参碱部分相连，进一步通过H2-2′(δH3.45)/H2-3′(δH.57)/H2-4′(δH.65)/H2-5′(δH.52)/H2-6′(δH3.52)的H-HCOSY相关，以及H2-2′/H2-4′和C-5(δC73.4)之间的HMBC相关得到了证实。

化合物5

化合物5(alopecurineB)以无色晶体形式从MeOH–H2O(2:)，mp–°C，[α]D25+3.2(c.0，MeOH)中获得。根据3CNMR和HRESIMS数据(m/z.[m+H]+，计算值为C5H23N2O4，.)，确定其分子式为C5H22N2O4。红外光谱显示羟基(cm-)和羰基(和cm-)的吸收带。5的H和3C核磁共振谱显示存在四个特征低场质子[δH4.46(H，ddd，J=4.2，.6，3.0Hz)，4.05(H，t，J=6.0Hz)，3.99(2H，s)]，三个羰基(δC.3，75.0，74.6)，一个含氧的季碳(δC76.3)，一个连接到杂原子的甲基(δC66.2)，三个连接到杂原子亚甲基(δC57.8，49.3，49.)。根据包括H–HCOSY、HSQC和HMBC的二维核磁共振实验，可将5的H和3C核磁共振数据进行归属。

5的化学结构与alopecurineA(9)有很大的相似性。有趣的是，5和alopecurineA的DNMR谱非常相似，但它们的2DNMR谱有许多不同。在H?HCOSY谱中，H-2a（δH4.46）/H2-3a（δH2.3，.92）/H-4a（δH2.64）、H-8a（δH.80）/H-9b（δH.78）/H-0a（δH3.0）和H-（δH4.05）/H2-2a（δH2.09，.98）/H-3b（δH.66）/H-4a（δH2.40）之间的相关,得到三个片段C-2到C-4、C-8到C-0和C-到C-4的存在。此外，H2-3、H2-4、H2-7和C-5(δC.3)、H2-2、H2-8、H2-和C-6(δC74.6)、H2-、H2-3、H2-4、H2-7和C-5(δC75.0)之间以及H2-9、H-、H2-2和C-7(δC76.3)之间的HMBC相关支持了三个羰基(δC.3、74.6、75.0)在C-5、C-6和C-5处以及C-7处的含氧季碳(δC76.3)的位置。最后，通过单晶X射线衍射验证了5的结构，得到了一个小的Flack参数?0.03(8)，允许5的绝对构型为7R和R。

化合物6

化合物6为棕色油状，根据其HRESIMS数据(m/z.[m+H]+，计算值为C5H23N2O2，.)确定其分子式为C5H23N2O2。红外光谱在cm-处吸收峰，表明存在羰基官能团。6的H和3C核磁共振数据与氧化苦参碱(0)相似，除了在C-7(δC43.6)和C-(δC55.0)处没有两个甲基，存在额外的双键(δC36.8、08.9)，C-5、C-6、C-8和C-2的化学位移从δC35.8、67.9、25.2、29.4转移到δC32.0、68.7、28.3、25.9，表明C-7和C-的甲基取代了6的双键。这一结论得到了H-7α(δH4.20)、H-7β(δH3.90)和H-5(δH2.06)、H-6(δH3.68)以及H-6和C-7(δC08.9)、C-(δC36.8)、C-7(δC42.6)、H-7α和C-6(δC68.7)、C-以及H-8b(δH2.2)和C-7、C-之间的H-HCOSY相关的证实。通过分析6的NOESY相关和HNMR谱耦合常数，确定了6的相对构型。在NOESY谱中，H-7α与H-5、H-4b(δH.82)、H-6与H-4a(δH.94)、H-5之间的相关，以及H-7β与H-5、H-6之间缺乏任何观察到的相关，以及H-5和H-6之间的耦合常数(J5-6=4.0Hz)，表明H-5和H-6具有相同的取向。计算得到的S,5S,6S-6的CD光谱与实验值符合，从而确定6的绝对构型为S,5S,6S。因此，化合物6被确定为7，-脱氢-氧化苦参碱。

化合物7

化合物7，以无色晶体形式从MeOH–-H2O(2:)，mp57–58°C中分离出来，在m/z26.[m+H]+(计算值为C5H2N2O2，26.)处，通过HRESIMS显示了C5H2N2O2的分子式。将7的H和3CNMR数据与苦参碱的H和3CNMR数据进行比较，发现这些化合物的结构相似。最显著的差异是苦参碱中不含亚甲基(C-0，δC57.3)和两种甲基(C-5，δC35.4；C-6，δC63.8)，7中存在额外羰基(δC69.9)和双键(δC30.8，.4)的信号。在HMBC谱中，H-2a(δH4.32)、H-8b(δH.45)、H-(δH3.38)、H2-7(δH4.69、3.42)和C-6(δC30.8)之间以及H2-3(δH.96、.76)、H2-7和C-5(δC.4)之间的相关表明，C-5和C-6之间存在双键。此外，H-2a、H-8b和C-0之间的HMBC相关(δC69.9)表明，额外的羰基位于C-0。7的完整结构通过单晶X射线衍射得到证实，其指示Flack参数为-0.2(2)。因此，化合物7被确定为0-氧-5,6-脱氢苦参碱。

化合物8

化合物8的HRESIMS峰位于m/z.[m+H]+(计算值为C5H23N2O2，.)处，其分子式为C5H23N2O2。8的3CNMR数据与槐定碱(4)相似。观察到的主要差异是8中存在额外的羰基信号(δC72.)，4中不存在与杂原子相连的亚甲基(δC50.6)，C-2、C-6和C-9的化学位移从δC56.8、63.6、22.8移动到δC44.，59.5和3.7。这表明，在4的C-0处的亚甲基(δC50.6)被羰基(δC72.)取代，这已通过H-HCOSY和HMBC相关得到验证。利用H-6和H-2α、H-4α、H-7α和H-4α以及H-和H-8b之间的NOESY相关，推导出8的相对构型。因此，化合物8在结构上被确定为0-氧化槐定碱。

活性研究

由于某些苦参碱类生物碱对乙型肝炎病毒(HBV)具有较强的抗病毒活性，因此还对化合物-7在HepG2.2.5细胞中的抗HBV活性进行了评价。所有分离的生物碱均表现出抑制HBsAg的作用。特别是化合物、4、5、0和4在0.2或0.4mM的非细胞毒性浓度下，分别显著抑制HBsAg分泌37.2%、44.3%、46.0%、38.3%和40.2%，这表明这些生物碱的效果与苦参碱相当(0.4mm时为34.7%)，比阳性对照拉米夫定(3TC，.0mm时为3.5%)活性更好。化合物2、3、7、8、、2和7对HBsAg的抑制作用较弱，分别为29.5%到33.8%。比较4和的结构和活性，发现在C-5的羧基上引入吡啶环可以增强抗HBV活性和细胞毒性。此外，5(46.0%)和9(4.%)的HBsAg抑制作用表明C-5-C-6键的断裂对抗HBV活性产生积极影响，而C-6-C-7键的断裂似乎对抗HBV活性不利。

提取分离

在室温下，将25.0kg干燥苦参根用95%乙醇水溶液三次提取。将粗提物分散于H2O中，用%HCl酸化至pH4，然后用CHCl3萃取除去中性组分。随后，用NH3·H2O调节水层pH值为9，用CHCl3萃取，得到生物碱提取物(g)。生物碱提取物在大孔树脂(DiaionHP-0)上进行柱层析，以EtOH-H2O(0:90、30:70、50:50、70:30和95:5)梯度洗脱，得到-5个组分。用硅胶CC和CHCl3-MeOH(98:2→50:50)分离组分4(87.7g)，得到4个亚组分(4.-4.4)。用制备性HPLC(MeOH-H2O-Et2NH，65:35:0.0)进一步分离4.3(2.0g)，得到化合物(7.4mg)、3(9.5mg)和4(2.mg)。组分4.4(7.4g)用SephadexLH-20cc(MeOH)分离，然后用制备性HPLC(CH3CN-H2O-Et2NH，35:65:0.0)纯化得到2(7.3mg)和5(2.7mg)。用ODS(MeOH-H2O，30:70→00:0)分离组分2(86.g)，得到6个亚组分(2.-2.6)。用SephadexLH-20(MeOH)分离2.2(23.7g)，然后制备HPLC(MeOH-H2O-Et2NH，30:70:0.0)，得到5(20.4mg)、9(5.0mg)和0(78.6mg)。组分2.3(8.3g)经SephadexLH-20(MeOH)和ODS-CC(MeOH-H2O，5:80→00:0)分离得到6(7.9mg)和7(7.2mg)。将组分3(69.g)置于硅胶柱(CHCl3-MeOH，98:2→50:50)中，得到部分3.-3.8。用制备性HPLC(MeOH-H2O-Et2NH，55:45:0.0)纯化3.4(26.9mg)，得(23.0mg)和2(9.6mg)。用ODS柱(MeOH-H2O，30:70→00:0)分离组分3.5(6.8g)，得6(6.7mg)和7(5.8mg)。用ODS柱(50:50→00:0)、Sephadex-LH-20(MeOH)和制备HPLC(MeOH-H2O-Et2NH，60:40:0.0)分离3.5(20.9g)，得8(3.8mg)、3(36.6mg)和4(7.2mg)。

总结

本文介绍了从苦参根中分离得到8种苦参碱类生物碱，分别为：flavesinesG-J(-4)、alopecurineB(5)、7,-脱氢-氧化苦参碱(6)、0-氧-5,6-脱氢苦参碱(7)和0-氧化槐定碱(8)，以及9种已知的类似物(9-7)。化合物的结构新颖之处在于化合物-3是第一个具有D环开环的天然苦参碱类生物碱，而化合物4代表了一个前所未有的由苦参碱和哌啶构建的二聚结构，5是具有C-5-C-6键断裂的苦参碱类生物碱的第一个例子。与苦参碱相比较，这些新生物碱由于其独特的结构特性对乙型肝炎病毒(HBV)的抗病毒活性更强。提取分离上先通过调节PH得到粗生物碱层，再进行分离。先使用大孔吸附树脂粗砍，再利用硅胶，ODS等方法细分，最后用制备HPLC纯化化合物，且流动相加二乙胺。

本文于年0月9日在线发表于ACS旗下期刊JournalofNaturalProducts。

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